5-Podstawione urydyny i 2-tiourydyny typu xm⁵(s²)U są natywnymi elementami sekwencji antykodonów cząsteczek tRNA/mt-RNA, gdzie pełnią zasadniczą rolę w procesie dekodowania informacji genetycznej. W niektórych przypadkach, ich brak w pozycji wahadłowej tRNA powoduje całkowite zahamowanie syntezy białek, a w konsekwencji pojawienie się poważnych objawów chorobowych, np. brak 5-taurynometylo-2-tiourydyny w sekwencji ludzkiego tRNA^(Lys) hamuje proces translacji, co powoduje pojawienie się symptomów chorobowych określanych jako syndrom MERRF. W tym kontekście chemicznie modyfikowane oligorybonukleotydy stanowią dogodne narzędzie do badań wpływu modyfikacji na efektywność
i poprawność rozpoznania antykodon-kodon w rybosomalnym procesie biosyntezy białek. W przypadku syntetycznych, terapeutycznych RNA tj. antysensowe RNA, siRNA, obecność nukleozydów xm⁵(s²)U umożliwia osiągnięcie lepszych właściwości terapeutycznych:

i/ zwiększenie stabilności syntetycznych oligomerów w warunkach in vivo (nadanie/zwiększenie odporności na aktywność nukleaz);

ii/ zwiększenie powinowactwa względem docelowej cząsteczki RNA;

iii/ zwiększenie selektywności względem docelowego RNA;

iv/ zwiększenie podatności na katalityczną degradację patogennej cząsteczki mRNA;

v/ ograniczenie możliwości niespecyficznego oddziaływania z białkami.

 

W konsekwencji, prace syntetyczne związane z 5-podstawionymi urydynami
i ich 2-tioanalogami zarówno w aspekcie celu jak i narzędzia do syntezy innych połączeń są przedmiotem zainteresowania wielu laboratoriów.

 

Opisane w literaturze strategie syntezy nukleozydów typu xm⁵(s²)U oparte są o reakcje substytucji nukleofilowej w pozycji C-5,1 (pozycja allilowa). Reakcje wykorzystują jako substrat 5-chlorometylo(-2-tio)urydynę lub czwartorzędową sól amoniową 5-pirolidynometylo(-2-tio)urydyny. Pierwszy z substratów jest znacznie bardziej uniwersalny i szerzej wykorzystywany. Aktywacja pozycji C-5,1 chlorem daje możliwość jego podstawienia aminami pierwszorzędowymi, azydkiem, alkoholanami, estrami aminokwasów, solą tetrabutyloamoniową tauryny. Mimo niewątpliwej użyteczności 5-chlorometylo(-2-tio)urydyny w syntezie xm⁵(s²)U ma ona trzy poważne wady:

i/ jest nietrwała (łatwo ulega hydrolizie);

ii/ konieczność prowadzenia S_N wyłącznie w bezwodnych rozpuszczalnikach organicznych,

iii/ w wielu przypadkach, szczególnie dla 2-tio analogu obserwowana jest niska wydajność S_N.

 

Z kolei wykorzystanie czwartorzędowych soli amoniowych 5-pirolidynometylo(-2-tio)urydyny     ogranicza     się      w     literaturze    do     reakcji
z komponentami aminokwasowymi tj. estry glicyny oraz sól tetrabutyloamoniowa tauryny. Wydajność opisywanych reakcji nie była zadowalająca, a w przypadku syntezy 5-podstawionych 2-tiopirymidyn obserwowano utlenienie funkcji 2-tiokarbonylowej.

 

W ramach zrealizowanego projektu przetestowaliśmy nową grupę opuszczającą w położeniu C-5,1 – grupę piwaloiloksylową (PivO), która w porównaniu z innymi grupami typu RC(O)O- ma tę zaletę że znacznie trudnej ulega hydrolizie/aminolizie. W rezultacie możliwe jest jej podstawienie w reakcji 5-piwaloiloksymetylo(-2-tio)urydyny z różnorodnymi nukleofilami (aminami, alkoholanami, aminokwasami).

 

Celem projektu jest zbadanie użyteczności grupy 5-piwaloiloksymetylowej urydyny i 2-tiourydyny zarówno odblokowanych na rybozie jak i zabezpieczonych grupą 2’,3’-O-izopropylidenową, w reakcjach z odczynnikami o charakterze nukleofili, w zróżnicowanych warunkach preparatywnych (rozpuszczalniki, temperatura).

 

Korzyść przyjętej metodyki w stosunku do istniejących w literaturze wynika ze:

a) stabilności 5-piwaloiloksymetylourydyny i 5-piwaloiloksymetylo-2-tiourydyny w warunkach reakcji umożliwiających ich otrzymanie;

b) możliwości prowadzenia reakcji S_N w zróżnicowanych warunkach preparatywnych;

c) stabilności grupy 2-tiokarbonylowej w 5-podstawionych pochodnych 2-tiourydyny;

d) możliwości aplikacji opracowanych protokołów do syntezy modyfikowanych fragmentów RNA.

 

Praca jest współfinansowana w ramach XV konkursu RKN PŁ, czerwiec 2014r.

 

Wyniki badań zaprezentowane zostały w postaci komunikatu posterowego na 32. Zimowym Zjeździe Sekcji Studenckiej PTChem we Wrocławiu. W dalszej części praca ta  zostanie opublikowana.